先睹为快
靶点
羧酸酯酶carboxylesterase（LαE7）PDB ID：4FNG
筛选化合物库
23,000硼酸类市售化合物的分子库
计算方法
共价虚拟筛选（Covalent Virtual Screen）
计算软件
DOCK3.6（http://covalent.docking.org/）
单位与作者信息
澳大利亚国立大学的Colin J. Jackson教授，
魏茨曼科学研究所的Nir London教授
发表杂志
The Proceedings of the National Academy of Sciences
计算流程
本文作者用共价抑制剂筛选的DOCKovalent算法，针对LcαE7的蛋白晶体结构筛选了23000硼酸分子库。手动检查对接结果中排名前500（top2%）的结合模式，最终，综合直觉、价格和商业用途等因素挑选出5个候选化合物, 实验测试均为nM级别。
背景介绍
随着世界人口的增加，农业生产力对维持粮食安全至关重要。杀虫剂可以控制农业害虫和病媒，进而保障了全球粮食安全和健康。就全球健康而言，杀虫剂是抵御许多传染病的第一道防线；在发展中国家，杀虫剂尤其重要，因为在发展中国家，昆虫传播媒介占所有传染病的近20%，然而，杀虫剂的广泛使用已经选择出了具有抗药性的昆虫。自20世纪40年代以来，报告抗药性的昆虫种类迅速增加，已超过580种。抗药性使杀虫剂失效，导致了杀虫剂使用量的增加，对环境造成了严重的影响。抗药性广泛存在，已然成为紧迫的全球性问题。有机磷酸酯Organophosphates和氨基甲酸酯carbamates是目前使用最广泛的两类杀虫剂。它们通过对亲核活性位点的丝氨酸残基磷酸化/氨甲酰化，来抑制胆碱能神经肌肉连接处的乙酰胆碱酯酶(AChE)，导致乙酰胆碱在生物体内不断积累，最终导致其无休止的神经信号传导和死亡。对有机磷农药（OPs）等杀虫剂的抗性通常涉及羧酸酯酶carboxylesterases (CEs)对OPs的分离或水解。克服抗药性主要集于开发具有新的作用方式的新型杀虫剂，尽管这些新靶点中有许多显示出希望，但生物化学靶点的数量有限，而且新靶点对靶点不敏感和代谢抵抗的问题也不可避免。既然，杀虫剂的抗性通常涉及羧酸酯酶，抑制羧酸酯酶是可以恢复已形成抗性的OPs的有效性。这种通过抑制杀虫剂抗性所涉及的酶来提高杀虫剂的效力（增效剂）的最突出的一个案例就是胡椒基丁醇，可用于增强氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯的活性。
增效剂的概念可以进一步具体地针对已经进化成具有代谢抗性的酶，从而将杀虫剂的功效恢复到抗药性前的水平。因此，可以针对杀虫剂抗性的理想靶标羧酸酯酶，如LcαE7，设计消除抗药性的抑制剂（图1）。LcαE7通过典型丝氨酸水解酶机制催化脂肪酸底物的水解。已知硼酸与丝氨酸水解酶的丝氨酸形成可逆共价加合物，其模拟了羧酸酯水解的过渡态几何结构，因此具有高亲和力。
图1. 有机磷杀虫剂OPs增敏剂概述
图片来源PNAS
计算方法和结果部分
本文作者使用DOCK3.6软件里面的共价抑制剂虚拟筛选的通用方法DOCKovalent算法（http://covalent.docking.org/），针对LcαE7的蛋白晶体结构（PDB 编号：4FNG）筛选了23,000硼酸类市售化合物的分子库，手动检查对接结果中排名前500（top2%）的结合模式，最终，综合直觉、价格和商业用途等因素挑选出5个候选化合物。
蛋白的前处理时将关键残基Ser218设置为去质子化状态，His471设为双质子化状态；在配体准备过程中，由于无法参数化B原子，用C原子取代，这种替换并不会影响打分结果。共价对接中将形成的B-Oγ键长设为1.5 ± 0.1 Å，键角Cβ-Oγ-B = 116.0 ± 5° 和 Oγ-B-R（Ligatom）=109.5±5°。并且在测试化合物的手动选择中，优先选择硼酸的羟基占据氧阴离子孔（由Gly136、Gly137和Ala219的主链氮形成）（图2）。
图2. 虚拟筛选过程中硼酸分子与LcαE7酶Ser218残基配位模式
图片来源PNAS
筛选的5种化合物都有一个苯基硼酸（PBA）亚结构。作者解决了LcαE7酶与化合物1-5的共晶结构(图3-紫色棍棒结构)，很大程度上验证DOCKovalent预测的对接模式（图3-黄色棍棒结构）。筛选的5个硼酸化合物对野生型 LcαE7酶的Ki值均低于12 nm，其中最强的化合物3的Ki值为250 pm。对于突变型Gly137Asp LcαE7酶而言，化合物2的抑制活性表现最好（Ki=29nM）。
图3. 共价对接预测的lcαe7的有效抑制剂的化学结构和复合物共晶结构
图片来源PNAS
为了在保持良好的野生型效价同时提高对突变体gly137asp的抑制作用，作者基于构效关系的研究，进一步优化了抑制剂的结构，得到了目标化合物3.9和3.10，并结晶了3.10抑制剂和突变体Gly137Asp LcαE7酶的共晶体（图4)。
图4. 化合物3和3.10的化学结构式和复合物的结合模式图
图片来源PNAS
与抑制剂3相比，发现3.10的取向更加保守，3-溴取代基与活性中心高度互补，5-苯氧基取代基朝向活性中心的狭窄空间，避免了与Asp137侧链的立体位阻。最令人惊讶的是，化合物3.10采用的是四面体几何结构，而不是化合物3观察到的三角平面几何结构。四面体硼酸化合物与丝氨酸水解酶的亲和力结合更高，这也进一步解释了3.10化合物在活性上高于3化合物6.1倍。
进一步的药理实验证明，这类化合物可以选择性作用于LcαE7，在高剂量下对哺乳动物无害；通过对蝇蛆菌株的测试结果显示，LcαE7酶抑制剂可以作为增效剂来恢复OPs杀虫剂的药效；并且在毒死桃-马铃薯蚜虫中也起到了协同作用，这表明硼酸类LcαE7酶抑制剂具有广谱杀虫剂增效剂的潜力（图5）。
图5. 硼酸化合物的酶选择性验证和OPs杀虫剂协同作用实验
图片来源PNAS
总结
本文报道1了一种利用计算设计高效特异性的LcαE7酶抑制剂。利用DOCKo -valent算法，基于靶点LcαE7酶结合口袋的Ser218的共价作用模式，对23000硼酸数据库搜索，得到了一系列的共价小分子化合物，再结合构效关系的研究，发现了活性更佳的先导化合物。这些化合物逆转了两种不同害虫的抗药性，可以在不影响药效的情况下大幅度减少杀虫剂的使用，可产生重大的经济和环境效益。
DOCKovalent算法是由Nir London教授2等人开发的一种高通量共价虚拟筛选的在线服务型数据库（http://covalent.docking.org）。DOCKovalent数据库包含了不同类型的亲电化合物，包含了醛类，硼酸类，氰基丙烯酰胺类等；并且大多配体的立体结构及构型都是事先准备好的，所以很适合研究者对感兴趣的靶点进行快速的共价对接，打分函数主要评价配体和受体的范德华力和亲电相互作用，并根据打分结果进行排序。
参考文献：
1. Correy, G. J.; Zaidman, D.; Harmelin, A.; Carvalho, S.; Mabbitt, P. D.; Calaora, V.; James, P. J.; Kotze, A. C.; Jackson, C. J.; London, N., Overcoming insecticide resistance through computational inhibitor design. Proceedings of the National Academy of Sciences 2019, 201909130.
2. London, N.; Miller, R. M.; Krishnan, S.; Uchida, K.; Irwin, J. J.; Eidam, O.; Gibold, L.; Cimermančič, P.; Bonnet, R.; Shoichet, B. K., Covalent docking of large libraries for the discovery of chemical probes. Nature chemical biology 2014, 10 (12), 1066.