破坏抗体表面正电荷分布优化抗体PK

很多文献提到抗体的表面电荷、净电荷或者pI会影响抗体的PK，今天转载一篇关于修改抗体表面电荷优化抗体PK的文章，讲解了破坏抗体表面连续的正电荷区域可以减少抗体的清除同时延长半衰期，来源：大分子研究员。

文章最后，我们会介绍如何通过WeMol实现文中的分析与设计工作，包括电荷分析和FR替换等，如果您已浏览过相关文献，可以直接跳转到最后一节。

背景

PK是抗体的重要成药性指标之一，是机体对药物吸收、分布、代谢和排泄的过程，单抗的PK可以描述为两个阶段：快速的分布阶段和缓慢的清除阶段。抗体的清除比较缓慢是因为抗体的恒定区可以与FcRn在酸性的内体中相互结合从而继续循环到细胞外，避免被细胞非特异性清除。影响抗体PK的因素包括：抗体聚集、抗体疏水较强、抗体带较高的正电荷、与细胞外基质的非特异性结合、高甘露糖、TMDD以及ADA等。

文章作者通过杂交瘤获得一个抗TDP-43的抗体，经过人源化后抗体保持了母抗的特性，但是在NHP中的清除速率较快，通过分析抗体的表面电荷发现抗体表面分布较大的阳性电荷区域，因此重新选择pI较低的germline做了人源化，新的人源化抗体不但保持了活性而且也延长了半衰期。

结果

使用人germline VH1-3/VK2-30框架区的人源化抗体被快速清除

结合TDP-43的鼠抗克隆号为ACI-5891，恒定区为鼠IgG2a，此抗体结合的表位位于TDP-43的C末端，具有人、鼠、猴种属交叉反应。ACI-5891鼠抗在小鼠疾病模型中单次给药30mg/mk半衰期为14天(图1a)。

首次人源化使用的人源重轻链框架区分别是VH1-3和VK2-30，恒定区为人IgG1抗体命名为ACI-5891.1，嵌合抗体名字为ACI-5891.5。人源化的抗体功能以及稳定新都保持与鼠抗一致(表1)。然而人源化以及嵌合抗体在NHP中的半衰期分别为4.6天和4.0天(图1b)，清除率分别为0.497mL/h/kg和0.716mL/h/kg(表2)。

对ACI-5891.1快速清除的研究

发现嵌合抗体以及人源化的抗体pk较短后，作者对抗体进行了系统的分析，包括：FcRn的结合、分特异性结合、抗体疏水性、糖型、TMDD和电荷分布等等。

结果显示嵌合抗体与人源化抗体与人FcRn具有pH-dependent binding(图2a，表1)，但是鼠抗、嵌合抗体和人源化抗体对鼠、人、NHP的FcRn结合并不一致(表3)，因此小鼠中的PK数据转化到NHP的相关性较差。

抗体的非特异性结合通过与一些负电荷的细胞外基质结合实验来模拟，包括heparin和insulin，ACI-5891.1和ACI-5891.5均没有非特异性结合(图2b)。根据对抗体结构的计算，ACI-5891.1表面没有明显的疏水区域且具有较低的聚集倾向(图2c)。当浓缩到120mg/ml抗体并没有发生聚集，粘度为3.0cP。ACI-5891.1的糖型表现正常，甘露糖含量正常(表4)。ACI-5891.1具有人猴交叉反应，猴血清中TDP-43浓度为800pg/mL(18 pM)，但在终点抗体的浓度为3.24nM大概为游离TDP-43的180倍，这说明TMDD也不是抗体快速清除的原因。然后在血细胞的表面也为观察到ACI-5891.1，血细胞的结合也不是抗体快速清除的原因。

选择新的人源germline对ACI-5891.5抗体进行人源化

根据以上结果，未能发现影响抗体清除率的原因，但是通过对数据的分析猜想可能是抗体携带的正电荷所导致，抗体表面分布较大量的正电荷区域 (图3a)。对抗体进行重新人源化，通过序列比对选择了与鼠抗相似度较高且携带负电荷的germline：VH1-69-2/VK2-28 (图3b)。

通过更换germline将鼠抗上较大的正电荷区域打断(VH：K74Q、R82aS和K73T；VK：K45Q)，人源化的抗体命名为ACI-5891.9，新抗体的净电荷为+4.3理论pI为6.9(表1)，计算的表面电荷较ACI-5891.1和ACI-5891.5更加的均匀(图4)。ACI-5891.9的活性和稳定性都与ACI-5891.5保持一致(图5，表1)。

ACI-5891.9减低了清除率

首先在转基因小鼠Tg32中比较了ACI-5891.1、ACI-5891.5和ACI-5891.9的PK(图6a，表5)。单次IV给药40mg/kg，ACI-5891.1清除率为0.428mL/h/kg，ACI-5891.5清除率为0.235mL/h/kg，ACI-5891.9清除率为0.183mL/h/kg；ACI-5891.9的半衰期为16.4天，ACI-5891.5和ACI-5891.1分别为9.6和10.8天。在NHP中ACI-5891.9的清除率为0.083mL/h/kg，半衰期为12.7天(图6b，表2)。综上，Tg32小鼠和NHP的数据都说明ACI-5891.9具有更低的清除率和更长的半衰期。根据NHP和Tg32小鼠的数据预测了ACI-5891.9在人体的表现，半衰期预计在27-30天左右，优于ACI-5891.1的17到22天。

讨论

这篇文章说明在抗体人源化的同时对抗体表面电荷的优化可以一定程度上改善抗体的PK。也强调在做人源化的时候需要确认人源germline的各项成药性指标，选择参数最优的germline，比如这篇文章提到的电荷（pI）。

文章一开始根据序列相似度最优挑选的人源化抗体的germline为VH1-3/VK2-30，虽然人源化的抗体可以保持亲和力和稳定性，但是PK与嵌合抗体一样比较低，随后更换了含较少碱性氨基酸（pI更低）的germline VH1-69-2/VK2-28，将鼠抗中重链K64、R82a、K73和轻链K45突变成不带电荷的氨基酸，破坏了抗体表面大面积的正电荷聚集区域。最终ACI-5891.9的电荷减少了5.8，从而延长了抗体的半衰期。

参考文献

1. Improved antibody pharmacokinetics by disruption of contiguous positive surface potential and charge reduction using alternate human framework

抗体人源化是对非人源抗体的二次改造，在改造过程中为保证良好的成药性，需要同时对潜在问题进行优化。如鼠抗PI偏高，可采用上文所述的方案，通过优化抗体表面电荷来改善抗体PK。除此之外，PTM性质、溶解度、粘度等都是评估抗体可开发性的重要指征。唯信计算自主开发的分子智能计算平台WeMol不仅可对上述所有指征进行计算和预测，还将抗体人源化工作涉及的步骤串联起来形成了一套简洁的自动化流程。另外，计算结果也可借WeMol强大的可视化界面进行呈现哦！

1、 基于序列分析pI

在WeMol中计算pI很简单，直接在序列编辑器WeSeq中打开要分析的序列，在下方的Table面板中即自动显示pI数值，同时Chart面板中会以柱状图显示pI的分布，如下图所示。

2、 基于结构分析表面电荷

使用WeMol的结构编辑器WeView打开抗体结构PDB文件，点击Patch Analysis功能，即可分析结构表面的静电荷及疏水残基的分布，自动标识出富集区域及对应的氨基酸残基，这对于预测基于非共价相互作用的可逆聚集现象也很有用，如下图所示。

如果没有抗体三维结构，可以在WeMol中使用AlphaFold、ESMFold等功能先行预测，使用生成的PDB文件再进行分析即可。

3、 在人源化时定向生成特定pI的人源化变体

使用WeMol的抗体人源化功能，可以使用特定pI的germline对抗体FR进行替换。在WeSeq中点击Humanization->Numbering->Search Template，系统会自动推荐germline模板及轻重链组合，推荐策略包括基于模板评分（侧重同源性与成药性，下图中1至4组）、人源化后pI的多样性（下图中5、6组为维持母本pI，7、8组为升高pI，9、10组为降低pI），可以按需选择。具体到上文文献中希望减少正电荷的场景，我们可以选择维持或降低pI的组合。 

当然，除了推荐的轻重链模板组合，也可以基于前面讲的基于germline序列的pI分析，自由指定轻重链分别使用特定pI的germline对抗体FR进行替换，非常灵活。

除了这些功能，WeMol中还可以自动化完成抗体人源化设计的全流程，涉及抗体建模、人源模板比对与挑选、回复突变评价和分组、序列生成、PTM分析、免疫原性预测、专利实施例段落生成等步骤，具有高成功率、易使用、速度快、功能全面等特点，经过了上百个人源化项目的湿实验验证，能有效降低时间和成本。

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