Nat. Catal. | What?蛋白主链竟能直接参与酶催化反应!

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通过QM/MM分子动力学模拟和同位素标记实验,作者发现在倍半萜SdS合成酶中去质子化-再质子化序列可以通过G1/2 helix这段保守结构域的主链羰基结合1分子水的催化来实现。

简介

萜类合成酶可以催化自然界最为复杂的环化串联反应,为自然界最大的一类天然产物提供骨架分子。很大一部分的萜类环骨架的生物合成需要经历碳正离子中间体去质子化失活和再质子化重新激活的串联过程,这一串联过程极大地丰富了碳正离子中间体的结构形态,与萜类天然产物的结构多样性密切相关。然而,人们对酶在去质子化-再质子化序列过程中所起到的作用知之甚少。一直以来,研究者们致力于在酶活性口袋中寻找催化该过程的碱性和酸性蛋白残基,但至今仍无确切答案。

近日,暨南大学药学院王永恒副研究员和德国波恩大学Dickschat教授等联合在Nature子刊Nature Catalysis上在线发表了题为“Catalytic Role of Carbonyl Oxygens and Water in Selinadiene Synthase”的研究论文。运用QM/MM分子动学模拟,作者发现在倍半萜SdS合成酶中去质子化-再质子化序列可以通过一段保守结构域G1/2 helix的主链羰基结合1分子水的催化得以实现,而实现这一过程所涉及的立体化学得到了同位素标记实验的证实。

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图1. 酶如何提供碱性/酸性残基参与到去质子化-再质子化序列中。图片来源:Nat. Catal.

 

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图2. 底物反应构象推测。图片来源:Nat. Catal.

主要内容

通过分析产物的绝对构型,作者推测出两种可能的底物反应构象(exo和endo,图2),然后利用酶蛋白晶体结构建立了两种可能构象的酶-底物复合物全原子模型。通过分析底物态的QM/MM分子动力学轨迹,作者发现这两种构象的底物与酶的作用方式有很大的区别。exo-底物的两个烯基氢与G1/2 helix两个残基Asp181和Gly182的主链羰基分别形成氢键作用,这拉近了合环原子之间的距离,说明这些主链羰基有识别底物构象的作用(图3a)。

进一步的计算与模拟表明,exo-底物可以形成稳定的合环中间体(10R)-A+,而且能量上更为有利;另外,Gly182的主链羰基能通过静电作用稳定关键合环中间体(10R)-A+,从而确定了exo为底物的反应构象。

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图3. SdS酶催化关键结构。图片来源:Nat. Catal.

分析中间体(10R)-A+的结构,作者发现H10与Gly182的羰基氧能形成稳定的氢键作用,于是推测Gly182的羰基很可能起到碱的作用,对中间体(10R)-A+的C10位进行去质子化(图3b)。绕C10-C11键旋转的势能面扫描表明,只要C1、C9、C12和C13近似共平面,H10就能自发地转移到Gly182的羰基上形成去质子化的中性中间体GB,而且顺时针旋转在能量上更为有利。同位素标记实验也表明该过程发生了绕C10-C11键的顺时针旋转。所以,理论计算和实验都支持Gly182的主链羰基作为去质子化的碱。

由于在中间体GB的C6位附近没有合适的残基可以提供质子重新激活底物(图3c),作者认为先前质子化的Gly182最适合充当酸的角色,但是由于其距离较远且朝向不适合的质子迁移,所有尝试均以失败告终。幸运的是,仔细分析QM/MM分子动力学轨迹,作者发现在去质子化的过程中,酶活性口袋中有1分子水正逐步向Gly182靠近(图3a, 3b, 3c),于是推测该水分子很可能介导质子迁移,实现底物的重新激活。

该假设得到了计算与模拟的支持,而同位素标记实验表明激活底物的质子确实来源于水分子,立体化学也与计算的结果相吻合。因此,Gly182的主链羰基在去质子化-再质子化序列中同时扮演了碱和酸的角色,而活性口袋中的1分子水起到了介导质子迁移的作用。

结论

本文利用QM/MM分子动力学模拟结合同位素标记实验,解决了萜类酶催化领域的一大机制难题⸺酶是如何直接干预去质子化-再质子化序列的,并揭示了该过程的许多催化细节。在这一过程中,酶蛋白主链羰基同时扮演了碱和酸的角色,具有启发意义:或许人们在这一问题上寻找答案的方向是错的,催化去质子化-再质子化序列的并不是常规的碱和酸。这或许是这一问题长期未得到解决的原因。这份研究打开了研究萜类生物合成中去质子化-再质子化序列催化细节的一扇大门,为其它萜类环化酶的研究指明了方向。

参考文献

1. Yong-Heng Wang, Houchao Xu, Jian Zou, Xian-Bo Chen, Yu-Qing Zhuang, Wei-Liang Liu, Ersin Celik, Guo-Dong Chen, Dan Hu, Hao Gao, Ruibo Wu, Ping-Hua Sun and Jeroen S. Dickschat, Catalytic Role of Carbonyl Oxygens and Water in Selinadiene Synthase, Nature Catalysis, 2022, accepted. DOI: 10.1038/s41929-022-00735-0.