JMC | 吡唑罗[3,4 d]吡嗪酮类DDR1抑制剂的设计、合成与评价

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中科院上药所郑明月研究员团队利用深度生成模型、激酶选择性筛选等计算手段,设计了一种新型DDR1抑制剂,该化合物能有效抗炎,在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中显示出良好的口服治疗效果。

背景介绍

阻断细胞因子是临床上常用的炎症性肠病 (IBD)标准疗法。突变的盘状结构域受体1(DDR1)会导致炎症细胞因子过度分泌,是IBD的重要靶点。目前已知的 DDR1抑制剂,具有靶点特异性差的缺陷。在本研究中,作者通过分子设计流程发现了候选的DDR1先导化合物。分子设计流程包括以下三个步骤:使用匹配分子对 (MMP) 算法获得片段库,训练生成模型并生成一个基于骨架的虚拟分子库,最后经过分子库虚拟分析和分子对接筛选搜索出先导化合物,如图1所示。

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图1. DDR1的基于骨架的分子设计流程。图片来源:JMC

主要内容

DC-1是良好的DDR1抑制剂骨架

在之前的研究中,作者发现了一个FGFR 抑制剂DC-1。作者比较DDR1与FGFR1的结合口袋(图2A),发现DDR1的结合口袋在DC-1的苯基区域有更大的扩展空间。如图2B所示,DC-1的哒嗪部分与DDR1铰链区的残基Asp702和Met704形成三个氢键,DC-1与DDR1晶体结构中的配体重叠良好。DC-1的N-苯基取代基到达DDR1环部分的溶剂暴露区域。这些结果表明 DC-1有望被改造为有效 的DDR1 抑制剂。

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图2. DC-1在FGFR1和DDR1中的结合构象与模式。图片来源:JMC

使用生成模型修饰骨架

作者用MMP算法穷举,从训练集中生成大规模的分子对集。在一对分子中,作者将满足氢键供体、可旋转键等要求的分子看做骨架,另一个则看做装饰分子,并在骨架上标记装饰基团的附着点。训练时输入带有附着点的分子,输出装饰过的分子。这里的生成模型采用注意力的编码器-解码器架构,编码器由双向循环神经网络组成,接受输入向量,将两个方向的隐藏状态汇总到解码器。如图 3A所示。生成模型每次装饰一个附着点,将生成的分子再输入装饰器模型。流程循环直到最后一个附着点被装饰,如图3B所示。

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图3. 生成模型的架构,以及生成的分子示例。图片来源:JMC

DDR1化合物库的生成

作者通过MMP算法对902个DDR/FGFR抑制剂切片得到的36.03亿个分子对训练集,训练模型生成了19929个分子。图 4A 展示了生成的分子和 9 个已发表的选择性 DDR 抑制剂的 t-SNE 结构多样性分布图。相比于已知的 DDR1 选择性抑制剂,生成的分子存在于更多样化的化学空间中。

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图4. t-SNE可视化生成的分子与已知的DDR1抑制剂的分布;选取用于合成的分子的流程图。图片来源:JMC

虚拟筛选化合物发现先导化合物

接下来,研究者对生成的分子进行虚拟筛选以发现更有效和有选择性的 DDR1 抑制剂。流程如图 4B所示。作者删除了PAINS化合物,接着依据理化性质过滤一批分子,剩下了6684 个结构。KinomeX 是一个预测激酶抑制剂的全激酶组多药理学效应的有效工具。为了提高激酶选择性,作者保留了KinomeX显示对 DDR1 显示预测活性概率大于0.5 和对其他 15 种激酶显示预测活性概率小于0.5 的生成分子。如图 5A 所示,生成的分子对 DDR1 的预测活性概率显著高于其他激酶。

剩余的 1648 种化合物通过 Glide 在 XP 模式下对接到晶体结构的配体位点。对接分数分布图表明,有 1540 种化合物的对接分数低于-6。为了可视化结构相似性和对接分数之间的关系,绘制树图 (TMAP) 以创建最小生成树的二维布局,该树根据相似性对分子进行聚类。图 5B 显示了剩余 1648 个分子的 TMAP,其中分子及其相邻分子具有密切的相似性值分别表示为树的点和终端分支。每个分子的对接分数由点的亮度表示,颜色越深表示对接分数越低,即可能具有更高的结合亲和力。结果表明,对接分数范围从-3到-15,并且随着分子结构特征的变化而变化。由于分子结构的相似性,子树的对接分数趋于一致。此外,作者还放大了TMAPs来说明前10个分子及其化学结构。结果表明,高分分子主要集中在两个区域,其中一些结构非常相似并归属于同一子树。其中,选择前2种化合物合成(如Scheme 1所示)和生物活性实验。化合物1和2对DDR1的IC50分别为10.2±1.2nM和10.6±1.9nM。化合物 2 以 Asp-Phe-Gly (DFG)-Asp-out 构象与 DDR1 结合,具有 II 型抑制机制(图 6)。在铰链结合区与Met704和Asp702形成了两个氢键,c-Helix中的linker amide和Glu672与DFG基序中的Asp784之间形成了两个额外的氢键。吡唑并[3,4-d]哒嗪酮骨架在铰链结合区与 Met704 和 Asp702 形成两个氢键,对维持活性有重要贡献。同时,酰胺接头与Glu672和Asp784形成了两个额外的氢键。

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图5. KinomeX预测的分子的活性的分布箱线图。生成的分子的TMAP图以及排名前10的分子。图片来源:JMC

为了进一步评估 SAR,作者设计合成并测试了化合物 18-25,结果总结在表 1 中。酶促测定表明化合物的抑制活性降低,在 R2 位置变化不大(化合物 2 对化合物 18-21)。当 2 的 CF基团被去除或移到对位时,化合物 18 和19对 DDR1 的效力显著降低。 用环己基 (20) 或正丁基 (21) 替换 CF3 取代的苯基也降低了活性。结果表明,2中的3-三氟甲基苯基基团可能与DFG-out构象形成的变构口袋深度结合,对于该化合物保持对DDR1的强抑制作用至关重要。根据上述 SAR 分析,作者设计并合成了 4 种新化合物(化合物 22-25)以阐述 R1 位置的 SAR。结果表明,R1位置的乙酰氨基苯基可以被苯基或取代苯基取代以保持强的DDR1抑制活性,IC50值范围为27.4至60.4 nM。初步 SAR 研究表明,R2 位置的 3-三氟甲基苯基对于化合物保持对 DDR1 的强抑制作用至关重要。同时,发现R1位置对多种苯基取代基的耐受性良好。

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图6. 化合物2的结合模式。图片来源:JMC

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表1. 化合物18-25对DDR1的体外抑制活性。表格来源:JMC

化合物2的靶点特异性

为了进一步评估化合物 2 的一般激酶选择性,作者评估了化合物 2 对一组 100 nM 的 430 种激酶的选择性。确定了在固定浓度的 ATP (10 μM) 下这 430 种激酶磷酸化的抑制百分比。如图7所示,那些抑制百分比>50%的激酶用红色圆圈标记,圆圈的大小与抑制比例一致。值得注意的是,结果表明,与其他已发表的选择性 DDR1 抑制剂相比,化合物 2 对 DDR1 表现出更高的选择性。从 7rh 的激酶选择性曲线来看,测试的 395 个非突变激酶中有 14 个显示出明显的结合(抑制率>65%)。化合物 6j 的IC50 值为 15.4 nM,在 BLM 诱导的小鼠肺纤维化模型中显示出良好的效果,对TRKB 和 TRKC呈现脱靶效应,这表明化合物 2 具有突出的激酶选择性。

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图7. 化合物2的激酶选择性。图片来源:JMC

化合物2抑制细胞中促炎细胞因子和DDR1自磷酸化的表达

鉴于 DDR1 在炎症反应中的重要功能,作者通过测量化合物 1 和 2 抑制LPS 诱导的促炎细胞因子(包括 IL-6、IL-1β 和 TNF)表达的能力来确定它们的潜在抗炎作用(图8a)。结果表明,化合物 2 以 10 μM的活性能显著抑制 LPS 诱导的促炎细胞因子在小鼠原代骨髓源巨噬细胞 (BMDM) 和人 THP-1 源巨噬细胞中的表达。此外,化合物 2 显示出对 LPS 诱导的 IL-6 表达的剂量依赖性抑制。化合物 2 抑制细胞中 DDR1 自磷酸化,EC50 为 34.4 nM,比阳性对照 DDR1-IN-1 更有效。

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图8.化合物2(a)抑制细胞中促炎细胞因子和DDR1自磷酸化的表达的生物实验结果(b) 改善dss诱导的小鼠结肠炎。图片来源:JMC

化合物2改善DSS诱导的小鼠结肠炎

作者在 DSS 诱导的 IBD 小鼠模型中进一步研究了化合物 2 的治疗潜力(图8b)。在化合物2处理的小鼠中,在施用DSS后第5天至第8天体重显著减轻;一致地,在化合物2处理的小鼠中粪便潜血评分降低。DSS 处理导致小鼠结肠长度显著减少,这通过化合物 2 处理得到显著改善。组织学评估显示模型小鼠第 9 天结肠切片炎症细胞浸润、上皮严重破坏和隐窝丢失,而在复合 2 处理的模型小鼠中,这些特征得到改善,并且急性结肠炎的组织学评分显著降低。因此,模型小鼠结肠切片中 IL-6、IL-1β 和 TNF 的表达明显增加,但在化合物 2 处理的模型小鼠中要低得多。类似地,血清中 IL-6、IL-1β 和 TNF 的浓度在模型小鼠中增加,但在化合物 2 处理的模型小鼠中也低得多。综上所述,这些结果表明,化合物 2 的给药在体内对 DSS 诱导的 IBD 产生了明显的治疗保护效应。

总结

本文介绍了一个基于骨架的用于开发潜在的 DDR1 候选药物的分子设计工作流程。对FGFR 抑制剂骨架建立了深度生成模型,而后对生成分子进行了虚拟筛选及分子对接以寻找骨架和不同官能团的最佳组合。最终确定的两种化合物对DDR1 表现出有效的抑制活性(化合物1 IC50 = 10.2 ± 1.2 nM,化合物2 IC50 = 10.6 ± 1.9 nM)。化合物2是迄今为止最具激酶选择性的 DDR1 抑制剂之一。该方法为进一步基于骨架的药物优化提供了宝贵的工具。

参考文献

Tan, X.;  Li, C.;  Yang, R.;  Zhao, S.;  Li, F.;  Li, X.;  Chen, L.;  Wan, X.;  Liu, X.;  Yang, T.;  Tong, X.;  Xu, T.;  Cui, R.;  Jiang, H.;  Zhang, S.;  Liu, H.; Zheng, M., Discovery of Pyrazolo[3,4-d]pyridazinone Derivatives as Selective DDR1 Inhibitors via Deep Learning Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation. J Med Chem 2021.