目前临床上80%肺癌的属于非小细胞肺癌（NSCLC），且其五年存活率不足15%。在NSCLC的肿瘤组织中，大约有20-80%表达了表皮生长因子受体（EGFR）。临床研究证明，L858R突变的EGFR的过量表达与活化是NSCLC的致病因素之一，故而EGFR抑制剂作为治疗NSCLC的药物得以广泛运用。
在临床治疗中，运用EGFR抑制剂会引起EGFR出现二次突变T790M，导致第一代的EGFR抑制剂吉非替尼等的失效；故而研究人员针对Cys797设计了第二代共价抑制剂使之能够牢靠结合在EGFR上，但是由于毒性过大没有上市；第三代在之前的基础上优化了抑制剂针对突变体的选择性从而降低了毒性，但是随着上市后的广泛运用再次出现了二次突变C797S，抑制剂无法通过共价结合到EGFR上。故而目前EGFR抑制剂研究的重点在于设计靶向L858R/T790M/C797SEGFR突变体的新型抑制剂。
暨南大学丁克研究团队设计合成了一系列以5-甲基嘧啶并吡啶酮为骨架的衍生物，其合成路线以及反应条件如下所示。研究人员首先基于商用的化合物9经过六步反应得到化合物16，在此基础上通过酰化反应得到8a，c-r。
图 1. 化合物8a,c−r的合成路线
图片来源JMC
5-甲基嘧啶并吡啶酮衍生物和作为参考的抑制剂分子（3-6）对L858R/T790M/C797S EGFR突变体以及野生型的体外激酶活性测试数据如表1所示。从结构上看，活性化合物多保留了参考化合物6的2’-氯，前期工作表明氯基团可以使得苯基的构象正确朝向EGFR的疏水口袋。化合物8h-j的活性测试表明，改变氯取代的位置或者没有氯取代都会使得分子失去活性。同时，在引入第二个取代基F后分子表现出良好的活性与选择性。其中8r-B对突变体的具有良好活性（IC50=27.5nM），同时是迄今为止报道选择性最好的第四代EGFR选择性抑制剂之一（对野生型的IC50>1000mM）。
表 1. 8a−r的体外激酶抑制活性
研究人员解析了8r-B与L858R/T790M/C797S EGFR突变体以及野生型EGFR的复合物的晶体结构（如图2所示）。8r-B竞争性结合于EGFR的ATP结合区域，分子呈现U形构象。5-甲基嘧啶并吡啶酮骨架与铰链区的Met793形成氢键，而侧链6-(2′-chloro-3′-fluoro)phenyl基团作为疏水基团占据由Lys745、Glu762、Leu788、Met766以及Met790形成的疏水口袋中。8r-B分子的尾部4-methylpiperazinylphenyl基团和propionylpiperidine直接暴露于溶剂表面, 而这也为进行一步优化分子的理化性质提供可能。基于晶体结构，可以观察到突变体EGFR的Met790与5-甲基之间的距离仅为3.5Å，保持有良好的疏水相互作用，而在野生型EGFR中亲水性的Thr790会削弱疏水相互作用，研究人员推测这是8r-B对突变体的选择来源。
图2. 8r-B-EGFRT790M/C797S （A）和8r-B-EGFRWT (B) 复合物的X射线衍射结构.
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为了进一步探究8r-B对突变体选择性的来源，研究人员通过分子动力学模拟和MM-GBSA对两个复合物体系的结合能进行计算。8r-B对野生型EGFR和突变体EGFR的结合能分别为-47.8 ± 2.7kcal/mol和 -57.5 ± 4.0 kcal/mol, 说明在热力学上8r-B倾向于和突变体EGFR结合。通过分解残基对结合能的贡献，标注出对选择性贡献排名前十的残基（如图3所示），其中排名靠前的多为疏水性残基，说明疏水作用是影响8r-B选择性的关键因素。此外，参考化合物3、6(活性如表1所示)对于野生型和突变体的结合能差值分别为1.5和2.2 kcal/mol，也印证了他们对于突变体没有选择性。
图 3. 计算上对选择性的能量贡献前十的残基(其中疏水性残基标注为绿色，亲水残基标注为红色)
图片来源JMC
总结来说，研究人员通过设计合成一系列靶向L858R/T790M/C797S EGFR突变体的化合物，其中8r-B展现了良好的活性和选择性。进一步的复合物结晶和理论计算阐明了8r-B选择性的来源。该研究工作不仅开发了有效的第四代EGFR抑制剂的先导化合物，同时为新型选择性EGFR抑制剂的理性设计提供了基础的结构信息。
参考文献：
Jiayi Shen, Tao Zhang, Su-Jie Zhu, Min Sun, Linjiang Tong, Mengzhen Lai, Rong Zhang, Wei Xu, Ruibo Wu, Jian Ding, Cai-Hong Yun, Hua Xie, Xiaoyun Lu, and Ke Ding Structure-Based Design of 5‑Methylpyrimidopyridone Derivatives as New Wild-Type Sparing Inhibitors of the Epidermal Growth Factor Receptor Triple Mutant (EGFRL858R/T790M/C797S) J. Med. Chem. 2019,62,7302-7308.