MixMD发现了PD-1全新的可药空腔，并通过虚筛得到结合于该空腔的名为1508的新型配体，为探索靶向PD-1−PD-L1复合物的癌症治疗提供了替代方案。
背景介绍
在过去的几年里，癌症免疫治疗引起了越来越多的关注。程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)通过调节T细胞功能促进自我耐受并抑制免疫反应。PD-1和程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)之间的相互作用导致免疫衰竭，保护癌细胞免受破坏。目前针对PD-1靶点以阻断PD-1和PD-L1作用的主要为单抗，少见有小分子药物。
在本研究中，作者用计算方法设计了一种名为1508的新型小分子配体，并且该配体与MixMD识别的全新的PD-1空腔结合，发现了PD-1中新的可药空腔。作者通过一组12.5 μs的MD模拟表明，配体1508分别与氨基酸残基Lys78和Arg86形成频繁的阳离子−π和氢键作用，并以不利于PD-1−PD-L1配合物形成的构象稳定PD-1 C’D环。这项研究强调了MixMD在暴露易受蛋白-蛋白复合物抑制的新腔体方面的能力，并为设计针对PD-1 C’D腔体的新分子奠定了基础，作为探索PD-1-PD-L1复合物在癌症治疗中的调节的替代方案。
结果
C’D环中新型/前所未有的疏水腔的识别
首先，作者通过有机探针的MD模拟（MixMD）和接触计算在PD-1中寻找新的相互作用位点，并发现含有芳香环或带正电基团的分子很容易被识别并对PD-1有一定的亲和力。
PD-1负责与PD-L1蛋白相互作用的前片被芳香探针明显识别(图1A,B)，支持MixMD识别PD-1表面已知空腔和相互作用位点的能力。此外，对突出的探针之间的结果进行聚类和比较，可以确定所有探针都访问的一个显著的公共区域–覆盖PD-1的C’D loop环。loop环被认为是分子识别的关键，C’D loop环通过氢键和盐桥与pembrolizumab抗体重链的CDR相互作用，有助于复合物的稳定。
PD-1PD-L1和PD-1benzene(replicate 6,REP6) MD模拟中两个最终MD结构的重叠证明了探针占据了C’D环路区域，靠近PD-1和PD-L1的主界面。此外，由于探针的存在，可以观察到该区域发生的构象变化。为了研究探针是如何进入空腔的，作者定义了C’D环周围苯的五种最具代表性的状态，并将其描述为与关键环残基的距离函数。作者发现了两个基团，一个被定义为结合态，用构象状态1表示，另一个被定义为接近非结合态，用构象0、2、3和4表示(图1C)。芳香探针在状态1的普遍存在主要是由于Leu79、Ala80、Ala81、Phe82、Pro83、Pro89、Gly90和Phe95残基的存在，这些残基的疏水性和芳香侧链可以与探针正常相互作用。
此外，带负电荷的残基(如Asp77、Glu84、Asp85和Asp92)的存在可能通过盐桥的建立有利于甲基铵在该区域的固定。束缚态构象中苯的存在导致C’D环形成一种构象，这种构象在腔内没有探针的情况下是不经常被访问的(图1D)。环的刚性随探针引起的构象变化而变化，表现出一种可能的构象选择现象。这些发现鼓励作者去寻找与这个腔体结合的小分子。
图1. MixMD结果及分析。图片来源：JCIM
虚拟筛选揭示能与C’D环路中的空腔相互作用希望分子
将Enamine REAL数据库的初始预处理(图2A)产生的约17 M分子用于对接分析。使用fpocket软件描述了PD-1benzene配合物replicate 6的空腔体积，并确定了对接初始结构的选择。该结果与之前获得的相同复合物的PCA值一起分析，表明该位点探针的存在能够稳定环路的开放构象，使其保持在高容量平台上。由于PD-1具有较大的空腔开口(982.24 Å3)和对苯的适应能力(构象状态1)(图2B)，作者选择了用于筛选的初始PD-1结构。这样一个结构位于靠近主成分分析（PCA）中心的位置(图1D，结合状态)，位于与未结合状态覆盖的区域相反的位置。VS步骤使得选择10个与提议的相互作用位点可能有亲和力的配体成为可能(图2C)。大多数配体的△G预测值在-6.9 ~ -6.0 kcal/mol范围内。通过对第一轮VS的可视化分析发现，具有芳香环的配体在相互作用和占据结合位点方面具有优势。
根据结合能评分和配体效率筛选出最佳的10万个配体进行集成对接实验。为这一步选择的蛋白质结构必须适应C’D环腔中的探针，同时也要彼此构象不同。因此，进行PCA，只考虑PD-1benzene配合物replicate 6的腔内探针(构象状态1)的帧。因此，可以根据它们在PCA结果中所占的象限选择10个结构编号。
根据平均结合能和配体效率考察了500个最佳配体，以追踪它们与PD-1的C’D环的相互作用。芳香基团再一次在选择的配体中发挥了重要作用。此外，酰胺基团的明显重要性被观察到，因为大多数配体在其结构的中心部分有这个基团。为了覆盖大部分重要的化学空间，作者通过改变芳香基团和体积较大基团的数量来选择结构，避免选择具有类似化学支架的结构。最后，作者选择了没有酰胺基的分子，以验证这个基团在稳定配体中的重要性。所有配体都通过了ChembioServer 2的毒性测试。
图2. 揭示PD-1 C’D loop环高亲和力配体的步骤流程。图片来源：JCIM
MD模拟揭示C’D环位点配体的稳定性和结合模式
对于短MD，其中5个配体保留在C’D空腔内显示dLig-Site至少有4个replicate在9 Å以下。这些分子共享一个中央酰胺基，通过与Arg86、Leu79、Ala81和Ser87相互作用起到锚定作用。配体3036与那些突出的分子具有相似的结构，但没有表现出相同的稳定性，这可以通过吡喃吡唑基4号位的氟原子和氢原子造成的空间位阻阻止了酰胺作为给氢基团，损害了氢键的建立，从而导致配体的不稳定性进行解释。为了使配体-蛋白相互作用结果更有说服力，作者进行了第二轮短MDs，证实了配体1508、8704、2810相互作用的稳定性。对这三种配体进行了更具体的ADMETox检测，结果证明所选分子之间没有毒性，且具有良好的药代动力学特性。
在重复5次长MD后，每个复合物的行为和相互作用都得到了更好的表征。配体1508表现出微小的均方根偏差(rmsd)变化(约4Å)(图3)，在整个模拟过程中都保持在相互作用位点。
图3. 在5x500ns MD模拟中，最稳定的配体的均方根偏差。图片来源：JCIM
通过对相互作用图（图4）的分析，作者初步验证了位于C’链和配体芳香基团上的Lys78的阳离子−π相互作用。这些相互作用证实了芳香基团对该区域分子相互作用的重要性。值得注意的是，尽管被认为是一种强相互作用，但与阳离子和富电子π系统的性质以及它们之间的距离相关的因素可以损害和削弱这种类型的相互作用。作者还验证了涉及位于配体中心区域的酰胺的氢键的建立，证明了该基团在稳定腔内分子方面的重要性。
图4. 在MD模拟过程中涉及三个最稳定的配体的相互作用分析。图片来源：JCIM
随后，作者对配体在该位点上的相互作用进行了更详细的分析，如图5。观察结果表明，末端官能团的存在，取决于它们的大小和方向，可能最终会导致涉及配体中心酰胺的相互作用的丧失。通过分析，作者指出了不同类型的相互作用对于稳定腔体内配体、识别分子靶点和配体的分子的重要作用。
图5. 通过在整个模拟过程中测量原子的距离来评估配体/PD-1相互作用的发生。图片来源：JCIM
PD-L1在PD-1界面上的相互作用可能受到提出的新C’D空腔中配体存在的影响
涉及PD-1和PD-L1之间的界面区域(CC‘到C’)的PCA，使验证该区域提议位点上配体存在的影响成为可能。作者随后对PD-1H2O、PD-1PDL1和PD11508的前β-面(AGFCC‘β-链)残基所覆盖的构象空间进行了比较分析，发现，尽管配体的存在并没有改变apo形态的覆盖空间的整体形状，但大多数可访问构象的中心会略微移向PD-L1覆盖空间的相反方向。
在所有模拟系统中考虑CC’/C’D环和C‘链的进一步分析表明，所有三种配体都以PD-1 apo模拟描述的整个景观中一个非常特定的构象(PC1和PC2的略负值)冻结了loop环(图6)。PD1PDL1复合物在PC1 < 0时几乎没有达到特定的构象，而是覆盖了与ψ84二面体高度相关的PC2值的很大范围。这意味着配体配合物所选择的C’D环的构象对于PD-L1配合物是禁止的。在最后一个复合物中形成“排除”区的主要原因似乎是PD-1的C’D环残基与PD-L1的F链、FG环和N端残基所采用的构象之间的潜在冲突。
图6. 由于在C’D环上所提出的配体的存在而产生的构象选择。图片来源：JCIM
小结
参考文献
Andrade L, Albuquerque A, Santos-Costa A, Vasconcelos D, Savino W, Sartori GR, Martins Da Silva JH. Investigation of Unprecedented Sites and Proposition of New Ligands for Programmed Cell Death Protein I through Molecular Dynamics with Probes and Virtual Screening. J Chem Inf Model. 2022 Feb 24. doi: 10.1021/acs.jcim.1c01122. Epub ahead of print. PMID: 35202544.