前言
粘蛋白型（GalNAc型）O-糖基化（以下简称O-GalNAc糖基化）是具有重要生物学功能的翻译后修饰类型 [1-3]。近年来，许多研究表明蛋白质特异性位点的O-GalNAc糖基化与肿瘤、神经退行性疾病等多种严重威胁人类健康的疾病密切相关, 如冠状动脉疾病，阿尔茨海默氏病 [4-5]。ppGalNAc-T酶是O-GalNAc糖基化修饰的起始糖基转移酶，在人体中，ppGalNAc-Ts家族由20种同工酶组成，根据其相似性分为Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If，Ig，IIa和IIb七个亚家族。ppGalNAc-T酶通过对底物位点的选择性催化，精密调控蛋白的O-GalNAc糖基化。已有研究报道，ppGalNAc-T酶催化结构域的catalytic loop在整个催化反应中至关重要。O-GalNAc糖基化的第一步是由一大类称为多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶（ppGalNAc-Ts）的酶完成的，该酶将GalNAc组从UDP-GalNAc转移到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基，得到产物TN（GalNAcα1-O-丝氨酸/苏氨酸）和抗原释放出游离UDP。
对于ppGalNAc-Ts体系，前人通过600ns的分子模拟来研究catalytic loop的构象转变。他们的结果表明，loop的闭合是与UDP-GalNAc结合引起。但研究未能揭示loop打开/闭合的完整动态过程，这个过程可能发生在数十微秒甚至更长的时间尺度内。
本项研究中，研究人员采用了长时间的分子模拟（约20μs），来研究模拟过程中UDP-GalNAc结合后T2中完整的catalytic loop打开/闭合的过程，模拟的结果捕捉到3个关键的构象变化中间态。另外，本研究发现，活性位点附近的若干氨基酸残基对调控catalytic loop的动力学过程起到关键作用，进而影响后续的底物识别。更进一步，结合计算的结果，研究人员对若干氨基酸位点进行了突变实验，并测定了它们的酶动力学、亲和力参数及糖基化位点。本研究揭示了catalytic loop在底物识别和糖基化位点选择性上的关键作用。
如何在分子模拟中构造马尔科夫模型（MSM）
最近2年，在分子模拟领域，对于感兴趣的构象变化的问题处理，研究，通过大量短时间MD模拟，构造马尔科夫状态模型（MSM）的方式被证明是行之有效的方法 [6] 。
构建MSM模型，一般要选择n个状态，使得它们涵盖了整个动力学行为，并且滞后时间τ足够长以成为马尔科夫模型，但又短得足以解决系统动力学问题。如果能够成功做到这一点，则MSM仅从其过渡矩阵提供有关系统的有价值的信息， 如下图所示，a图表示的是八段不同的短时间的模拟轨迹，每一段模拟中可以选取不同帧的由一个模拟时间步分开。B图表示将轨迹分解为若干离散状态，其中已识别出四个状态（绿色，蓝色，紫色和粉红色）。C图表示的是观察到的转换计数矩阵，d图是可逆转换概率矩阵，，通过对观察到的转换计数矩阵及其转置进行平均得到，以确保每个正向转换都可以发生相同次数的向后转换。每行的概率总计为1。e图是总体概率分布的饼图，这是概率矩阵的第一个特征向量。占比比较高的状态在热力学上也更趋于稳定。F图是轨迹数据集主要特征过程的示意图。绿色状态的特征通量为负，而所有其他状态的特征通量为正，因此此过程表示从绿色状态向其他状态的运动。总体总和为1，每个过程的特征通量总和为0。此过程的时标是五个轨迹时间步长。
图1：马尔科夫模型构建的方法
图片来源自J. Am. Chem. Soc
本文构造马尔科夫模型的过程
研究人员通过tICA降维和聚类分析，将199条时长 100-ns MD模拟的所有构象聚类为不同数量的微状态。然后，为了研究catalytic loop闭合过程中动力学的详细机制，进一步使用PCCA +算法将一个500状态的动力学模型归纳为5个宏观状态，随后使用不同的仿真数据集进行MSM的收敛性测试。
结果
catalytic loop打开→闭合过程中关键亚稳状态的发现
通过构建MSM模型，研究人员发现在闭合过程中识别出catalytic loop的五个亚稳态，即S1-S5（图2 A，B）。S1和S5状态分别对应于完全打开和完全关闭的状态，其他三个状态是loop闭合期间的关键中间状态。进一步分析过渡路径，揭示了两个主要的构象转变途径：S1→S2→S3→S4→S5和S1→S2→S3→S5（图2 C）。S1的结构特征类似于最初的开环构象，和主链的I253残基形成一个稳定的氢键（占71.3％）（图2 d，3 A，B，E，F）。从S1开始，catalytic loop首先过渡到S2状态，其中Y367失去与I253，W282和F361的相互作用，catalytic loop的结构朝向UDP-GalNAc的构象。然后S2可以进一步过渡到S3，在此期间catalytic loop到达接近封闭构象的区域，并且H365，Y367和F369的侧链可以与V330，W331，F377，L204，H145和UDP-GalNAc的尿嘧啶形成疏水作用（见图2 D，3 E）。
最终，从S3状态，catalytic loop可以直接转变到闭合的状态S5，或者经过另一个中间状态S4, 到达S5状态（见图2 C）。S5是完全闭合状态，其中H365，Y367，F369，F377，H145，L204，V330，W331和UDP-GalNAc的尿嘧啶基团可以形成稳定的疏水区域（见图2 D，3 E ，F）。这些相互作用网络有助于将catalytic loop稳定在封闭状态。
图 2:MSM模型确定了catalytic loop在闭合过程中存在5个亚稳态。（A）在前两个最慢tIC维度上，模拟中构象的自由能投影。（B）两个最慢的tIC上，模拟中构象的散点分布图。S1到S5分别用黑色，红色，绿色，蓝色和橙色表示。（C）源自MSM的五态动力学模型，每个圆圈代表一个亚稳态（D）每个宏观状态下具有代表性的构象展示
图 3: catalytic loop 闭合过程中关键的结构变化。（A）六个关键氢键在模拟过程中所占有的概率（B）每个亚稳态的HB占据H1，H2，H3，H4，H5和H6。（C）在每种状态下，催化环C末端区域螺旋占有的概率（D）距UDP–GalNAc小于3Å的距离内的水分子数量。（E）距离计算时几个残基对的定义（F）在每个亚稳态下d1，d2，d3，d4，d5和d6的测量距离。
图片来源自ACS catalysis
为了更好地观察监控整个loop闭合的过程，研究人员将所有MD的构型投影到第一个tIC以及回转半径（Rg）上。如图4 A 所示，在loop闭合期间，Rg的平均值从S1状态时的~10 Å减小到S5状态时的~7 Å。具体地，在S1中，W331，H365，Y367和F369的位置比较分散，形成了相对较高的R g值（见图3 E，F和4），等到了S5状态，完全闭合的构象S5显示出所有五个状态中均显示出最低的R g值（请参见图4）。
图4. S2是catalytic loop关闭动力学的关键中间状态。（A）散点图，每个MD构象都映射到第一个tIC上，H145，L204，V330，W331，H365，Y367，F369，F377和UDP的尿嘧啶部分（Ura）的回转半径(Rg) (B)每个状态（S1-S5）的代表性结构展示。
图片来源自ACS catalysis
UDP-GalNAc结合绑定促进了Catalytic-Loop的关闭
有趣的是，本项研究发现占比最高的状态不是闭合的状态S5, 而是中间态S2。分析表明，S2中catalytic loop的构象非常不均一，既包含开放的构象（有较高的R g值），也包含封闭的构象（较低的R g值，见图4 A）。而在到达S3之后，catalytic loop渐渐趋向闭合的状态，综合以上结果，研究人员推测S2是催化环闭合动力学的关键中间状态，在这期间，UDP-GalNAc可能参与促进了catalytic loop从开放形式向封闭形式的构象转变。为了验证这个假设，研究人员对apo T2结构（不与UDP-GalNAc结合的构象）进行了额外的模拟，目的是为了研究UDP-GalNAc在闭合过程中的作用。结果表明，UDP-GalNAc的存在可以使catalytic loop稳定在起始构象，甚至可以促进loop的闭合。相反的，当没有UDP-GalNAc之后，大约一半模拟的构象趋向转变为开放状态。进一步的分析表明，与UDP-GalNAc直接接触的几个关键残基，包括L204，V330和W331，在去除UDP-GalNAc之后经历了较大的结构波动。
图5. UDP–GalNAc的存在促进了催化环的闭合。
图片来源自ACS catalysis
结语
本项研究中，研究人员通过广泛的计算模拟，揭示了在UDP-GalNAc结合后T2中catalytic loop的闭合/打开运动的完整动力学过程。构建的马尔科夫模型（MSM）可以识别催化环在其闭合运动过程中的五个关键中间状态，这在之后的识别底物和后续的催化反应中起到了关键的作用。
参考文献：
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