ROS1重排临床可见于1-2%的非小细胞肺癌病例中，目前无选择性治疗药。云上用Fast ROCS方法对AstraZeneca虚拟化合物库进行虚拟筛选，经过综合评价得到了一系列高活性和选择性分子，活性最高可达nM级别。
ROS1重排可导致完整的ROS1酪氨酸激酶结构域与另一条染色体的伴侣蛋白融合，至今仍无选择性ROS1药物。本文作者尝试研发一种特异性的、选择性的ROS1抑制剂，以提供更好的疗效和耐受性。TrkA被选为密切相关的激酶抗靶点，用来度量化合物的选择性。
虚拟筛选是一种经典的药物筛选方法，对比湿实验可大幅提高筛选效率。本文采用配体和受体相结合的虚筛方案，基于FastROCS（OpenEye出品的以2D方法的速度进行基于形状的叠合和打分的方法）的工作流程搜索了阿斯利康的化合物库(100亿个分子)子集，鉴定出候选的骨架。然后枚举化合物库中对应的分子，经对接检验后合成了两个系列的化合物并测试生物活性。
1. 建立查询标准
通过多种标准选取了五个分子作为查询对象（图1）。将分子与ROS1的结合构象在空间中叠合，生成了空间形状约束和药效团特征。
图1. ROS1抑制剂的结构式。图片来源：JCIM
FastROCS用Tanimoto指标来计算分子间形状与特征的相似度，确定了2900个Tc score ≥ 1.2 的化合物。
有些分子虽有良好的分数，但可能缺乏关键药效团特征，删除这部分化合物后将剩下的1700个化合物与ROS1受体（PDB ID：3ZBF 和 4UXL）经GlideSP对接及肉眼查看，选择了400个化合物进行生物学测试。
实验证实 280 种化合物对 ROS1 具有活性，80余个分子对 TrkA 的选择性与ROS1相比超过 10 倍，新的 ROS1 活性化合物保持了对TrkA的选择性。
在13 种具有个位数纳摩尔ROS1 IC 50值的化合物中，最佳活性可达2nM。含有二甲基取代的双环内酰胺的化合物6的活性是13nM，其选择性是TrkA的3900倍，是鉴定出的化合物中最有效和选择性最强的。
表1. 6所在的其中一系列的分子的SAR分析。表格来源：JCIM
3. AstraZeneca虚拟筛选库（AZVL）
FastROCS等方法可以部署到数百个GPU上以筛选更大的虚拟数据库。AZVL涵盖了4000多个核心骨架和取代基，每个母核或骨架都有对应的合成模板及其试剂类别。AZVL 骨架有1到4个连接点，通过完全枚举，潜在的虚拟空间可达上千亿个分子，足以代表整个搜索空间。
图2. FastROCS的虚拟筛选流程。图片来源：JCIM
图 2 展示了FastROCS工作流程。它需要两个输入：Query Reader处理输入3D结构，Collection Reader加载预处理的虚拟库。
图3. FastROCS虚筛AZVL的结果与两步法虚筛全库的步骤。图片来源：JCIM
作者查询了1–5，拿到每个查询分数最高的1万个苗头化合物。Tc score分布如图3所示。平均每个分子的查询确定了60到270个不同的骨架，检查具有超过10个苗头化合物的簇，每个查询识别出15到60个骨架（图 3C）。经过对接打分后从理化性质预测、结构新颖性、化学合成可行性三个角度对骨架做进一步评估。
图3中归纳的两个步骤能够从全库中找到所有潜在的分子，所有七个骨架的枚举产生了近1700万个虚拟分子。预过滤及Lipinski过滤加上ROS1对接后，得到了容量近7000种化合物的库A。从中挑选了70种化合物进行合成。
作者计算了2000多种化合物，从1、3和4的嘧啶4位偶联，与多种仲胺的SNAr反应得到了化合物库B。
5. 苗头化合物的确认
在库A中，根据与4的3D相似性来选择化合物，R1=OMe 取代的化合物通常显示出略优的ROS1活性趋势，同时对TrkA 更具选择性（表 2）。16活性达到13nM，选择性达到近5000倍。27–30 表明换成简单的杂环则失去活性。
在库 B（图4）中，34 表明喹啉基团也具有良好的耐受性并且没有显示出可辨别的TrkA 活性。8是该组中最有效的化合物 (9nM)。
图4. 化合物库B的SAR分析及1和31在1 μM浓度下的激酶选择性。图片来源：JCIM
本文通过虚筛确定了三种不同的高效和选择性ROS1抑制剂先导化合物系列（ERK series、库A、库B），为选择性ROS1抑制剂提供了重要的苗头化合物。这种简单的基于形状的虚拟筛选与基于结构的匹配方法相结合，加上具有高合成成功率的虚拟库是快速推进项目的关键。
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Petrović, D., Scott, J. S., Bodnarchuk, M. S., Lorthioir, O., Boyd, S., Hughes, G. M., … & Sadowski, J. (2022). Virtual Screening in the Cloud Identifies Potent and Selective ROS1 Kinase Inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling.
https://doi.org/10.1021/acs.jcim.2c00644
