研究背景
纳米抗体（VHHs），以其分子量小、高稳定性、出色亲和力和易生成性，在生物医学领域备受关注。但要将这些骆驼源VHHs转化为医学治疗工具，人源化及序列优化是关键步骤。Merck公司和Scripps研究所领导的研究团队系统地人源化了两个骆驼源VHHs，针对自然细胞毒性受体NKp30，深入探究了影响其功能性的关键结构。
研究内容
1. 人源化及亲和力评价
研究人员选择了骆驼源VHH1和VHH2作为研究对象，它们的抗原是自然细胞毒性受体NKp30。首先对VHH1和VHH2进行了人源化，将野生序列的CDR1-3区域移植到与其同源性最高的人源序列上，并对Vernier或Hallmark区域的关键残基进行突变获得突变体，总共设计获得了VHH1-v1.1- VHH1-v1.10的10个突变体和VHH2-v1.1- VHH2-v1.18的18个突变体。之后对人源化突变体的结合亲和力、产量和纯度进行了表征。
（1）VHH1变体的结合亲和力分析
除了VHH1-v1.10变体外，VHH1系列的所有变体均展现出强大的结合亲和力。特别是，VHH1对Vernier区的关键残基V87L的人源化表现出良好的耐受性。此外，VHH1的Hallmark残基VEHG在位置49（E49G）和50（H50L）的人源化对结合亲和力影响不大，但G52W突变则不被耐受。
（2）VHH2变体的结合亲和力分析
VHH2的人源化对其结合亲和力产生了显著影响。例如，VHH2-v1.3变体的结合亲和力显著下降，而VHH2-v1.16变体则保持了较低的亲和力损失。Vernier和Hallmark区域的残基替换对VHH2的功能特性至关重要，尤其是Hallmark残基F42V的突变，显著降低了结合亲和力，凸显了这些残基在维持VHH2功能中的核心作用。
（3）非典型二硫键的功能多样性
在VHH1中，非典型二硫键的存在对其功能至关重要，而在VHH2中则未观察到此类二硫键。这一发现表明，非典型二硫键在不同VHHs序列中可能扮演着不同的角色，对VHHs的结构和功能多样性有着重要影响。
2. 结构分析
研究人员尝试对与人类NKp30胞外域复合的两个亲本VHH结构进行晶体化。成功获得了NKp30-VHH2复合物的结构（PDB ID: 9FWW），以及单独VHH1的高分辨率结构（PDB ID: 9FXF）。进一步利用AlphaFold2预测了NKp30-VHH1复合物的结构，发现预测结果与实验晶体结构高度一致，验证了预测结构的准确性，为深入分析提供了坚实基础。
（1）结构活性关系（SAR）分析揭示关键作用机制
研究人员对两组抗原-抗体复合物进行结构活性关系（SAR）分析，发现VHH1中的非典型二硫键对于维持CDR3环的生物活性构象至关重要，而VHH2中的Hallmark残基在维持CDR3环的稳定性和抗原结合中发挥了关键作用。
（2）分子动力学模拟揭示人源化影响
同时研究人员还对VHH1和VHH2的变体进行了分子动力学模拟，以评估特定Hallmark残基突变对构象多样性和结合亲和力的影响，模拟结果表明，人源化过程可能通过增加VHHs的构象多样性来影响其结合亲和力，这一发现对于指导VHHs的优化和人源化具有重要价值。
3. 数据挖掘
根据上述结构分析结果，研究人员对现有VHH NGS数据集和642个PDB结构数据进行了系统分析。
通过计算VHH序列中Hallmark区域的氨基酸位置间的标准互信息（Normalized Mutual Information，简写NMI，是一种用于评估两个数据分区之间相似性的指标，它基于信息论中的互信息，并对其进行标准化，使得结果在不同的分区规模下具有可比性）和结构关联分析，揭示这些位置间的相互依赖性和结构上的相关性。发现Hallmark基序在VHHs中具有多样性，并且与不同的抗原结合模式相关联。这一发现表明，Hallmark基序的差异可能直接影响VHHs的抗原识别和结合能力，从而影响其功能性。而非典型二硫键在VHHs中普遍存在，并且对于维持VHHs的稳定性和功能性构象至关重要。这些二硫键可能作为一种补偿机制，替代了传统抗体中轻链的作用，为VHHs提供了额外的结构支持和功能多样性。
研究结论
该研究通过实验表征、结构解析、结构预测、SAR分析、分子动力学模拟以及NGS和PDB数据的系统分析等，揭示了Hallmark残基和非典型二硫键在维持VHHs的生物活性构象中的关键作用。
结语
这项突破性的研究不仅推动了我们对VHHs结构和功能的理解，也为未来的药物开发和生物医学研究开辟了新的道路。让我们一起期待VHHs在治疗领域的更多创新应用！
扩展阅读
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